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登革熱IgG酶聯(lián)(ELISA)免疫吸附試驗

發(fā)布時間:2014-3-8 9:14:19??????瀏覽次數(shù):
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測單份和/或雙份血清IgG 抗體

試驗材料:
(1)抗原:
陽性抗原:采用C6/36 細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。
陰性抗原:未接種病毒的正常C6/36 細(xì)胞為陰性抗原對照。
(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 抗體;
(3)緩沖液:
包被液:pH9. 6 碳酸緩沖液;
稀釋液:pH7.4 PBS(含5%脫脂奶)
洗滌液:pH7.4 PBS-T(0.05%吐溫-20);
(4)顯色液:A/B 液
(5)終止液:4N H2SO4
(6)酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。
檢測步驟:
(1)用包被液按工作濃度稀釋抗原,100μl/孔,4℃過夜;
(2)棄去包被液,用PBS-T 重復(fù)洗滌3~5 次,甩干;
(3)將待檢血清用稀釋液從1:100 開始作2 或4 倍連續(xù)稀釋,加入抗原孔,
100μl/孔,同時設(shè)陰、陽性對照,37℃水浴1 小時;
(4)棄去血清,用洗滌液洗滌5~6 次;
(5)加酶結(jié)合物,用稀釋液按工作濃度稀釋,100μl/孔,37℃水浴1 小時;
(6)棄去酶標(biāo)抗體,用洗滌液洗滌6 次,甩干;
(7)加顯色液:于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B 液各一滴,37℃,避光3~5 分鐘;
(8)加終止液于每反應(yīng)孔,100μl /孔。
結(jié)果判斷:
于450nm(TMB)陽性對照孔OD 值/陰性對照孔OD 值,即P/N≥2.1,對照成
立;若待檢血清孔OD 值與陰性對照孔OD 比值≥2.1,則標(biāo)本為登革熱IgG 抗體
陽性,反之陰性。(陰性對照孔OD 值小于0.05 按0.05 記,若大于0.05 按實際
數(shù)值計算)
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意義:
陽性結(jié)果,表明曾受到DV 感染,>1:100 有診斷參考意義;
恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4 倍或4 倍以上升高則可確診。
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