漢坦病毒檢測難題終攻克
寧波大榭檢驗(yàn)檢疫局公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室從樣本制備到得出檢測結(jié)果，與原來使用特異性套式分型引物鑒定方法相比，CODEHOP RT-PCR檢測技術(shù)大幅度縮短了檢測時(shí)間，總耗時(shí)不到4小時(shí)，并且具有操作簡便、特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，填補(bǔ)了國內(nèi)外空白，達(dá)到了國際領(lǐng)先水平。
對鼠類樣本進(jìn)行檢測
病毒流行 急需技術(shù)防控
據(jù)了解，漢坦病毒可引起腎綜合征出血熱和漢坦病毒性肺綜合征，前者臨床上以發(fā)熱、出血、腎臟損害為主，國內(nèi)較常見；而后者主要臨床表現(xiàn)為，在4日左右的發(fā)熱、頭痛等前驅(qū)期癥狀后，出現(xiàn)以非心源性肺水腫和高病死率（52.4%~78.0%）為特征的急性呼吸衰竭，重癥3日～7日死亡，主要流行于美國，在阿根廷、巴西等國也發(fā)現(xiàn)過病例，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)，但有發(fā)生的可能。
研究表明，在自然界中存在較多型別的漢坦病毒，且不同型的致病性也不一樣。目前，漢坦病毒遍及亞洲、歐洲、非洲、美洲、大洋洲等70多個(gè)國家，其流行之廣，危害之重，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
在國內(nèi)，漢坦病毒的感染情況尤為嚴(yán)重，每年感染漢坦病毒導(dǎo)致發(fā)病的人數(shù)占世界報(bào)道病例數(shù)的90％以上，近10年來我國年報(bào)告發(fā)病人數(shù)一直高達(dá)4萬～6萬人，而且新疫區(qū)不斷出現(xiàn)。同時(shí)，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新型別的漢坦病毒，如哈巴羅夫斯克病毒、阿穆爾病毒、索托帕拉雅病毒等。
漢坦病毒不僅感染人，而且被許多嚙齒類動(dòng)物特別是食蟲目動(dòng)物長期攜帶，更嚴(yán)峻的是，這些作為傳染源的宿主動(dòng)物范圍仍在持續(xù)擴(kuò)大，而且一種宿主動(dòng)物還可能同時(shí)攜帶不同型別的漢坦病毒，這對該病毒的檢測防控提出了更大的挑戰(zhàn)。
因此，不斷拓展對該病毒的研究、完善技術(shù)防控體系成為了一項(xiàng)重大課題。大榭局公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室圍繞關(guān)鍵技術(shù)、疑難問題，經(jīng)過1年多的科研攻關(guān)，研制出了“漢坦病毒群的簡并RT-PCR”檢測技術(shù)。2012年5月，該技術(shù)的相關(guān)科研課題《鼠類攜帶未知病毒簡并PCR檢測方法建立與應(yīng)用》順利獲得國家質(zhì)檢總局立項(xiàng)，大大提升了大榭局的技術(shù)支撐力量。
眼光獨(dú)到 創(chuàng)新檢測方法
創(chuàng)新是科學(xué)的生命力?？蒲泄リP(guān)前期，經(jīng)過深入研究分析，大榭局研究團(tuán)隊(duì)清楚地認(rèn)識到，現(xiàn)有漢坦病毒的基因?qū)W檢測方法主要針對特定型別的漢坦病毒進(jìn)行檢測，但是由于漢坦病毒群型別眾多，同時(shí)具有快速進(jìn)化變異的特點(diǎn)，一些新型的漢坦病毒不斷出現(xiàn)，迫切需要建立能夠?qū)ξ粗蜐h坦病毒的檢測方法。
此外，該團(tuán)隊(duì)還考慮到，針對這些病原體，分離培養(yǎng)、直接或間接熒光抗體檢測、免疫組化染色、酶聯(lián)免疫反應(yīng)等傳統(tǒng)檢測方式，都需要較高的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和條件，相對而言核酸檢測技術(shù)的設(shè)備條件要求較低，并且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速便捷等特點(diǎn)。
因此，研究團(tuán)隊(duì)以獨(dú)到的眼光，首創(chuàng)應(yīng)用CODEHOP-PCR方法檢測漢坦病毒屬內(nèi)各類病毒。CODEHOP技術(shù)，是一種新型的簡并引物的設(shè)計(jì)方法，兼有簡并性和特異性的特點(diǎn)，能夠在保證PCR擴(kuò)增特異性的同時(shí)，可以擴(kuò)增編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而PCR是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。CODEHOP-PCR方法檢測取兩者之長，能夠方便、快速地?cái)U(kuò)增鑒別新的物種和親緣性較遠(yuǎn)的序列，當(dāng)懷疑一種未知病原體為某病毒或細(xì)菌家族的成員，或一個(gè)未知基因是某基因家族成員時(shí)，可以進(jìn)行有效驗(yàn)證，也可以用于某病毒家族成員內(nèi)新病毒的檢測和發(fā)現(xiàn)，很好地解決了常規(guī)PCR引物只能擴(kuò)增特定某種病原體或親緣關(guān)系較近病原體的問題。
以能夠檢測漢坦病毒屬內(nèi)已知和未知的病毒為目標(biāo)，大榭局研究團(tuán)隊(duì)充分發(fā)揮CODEHOP-PCR方法檢測的優(yōu)勢，設(shè)計(jì)篩選了一對簡并引物，對RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，提高了檢測的靈敏度、特異性，可以檢測國內(nèi)流行的流行性出血熱病毒中的漢城型病毒、漢坦型病毒，同時(shí)也可以檢測市面上試劑盒所不能檢測的其他型漢坦病毒，為該病毒的防控提供了一道堅(jiān)實(shí)的技術(shù)屏障。
開展轄區(qū)鼠類監(jiān)測
應(yīng)用廣泛 立足工作實(shí)際
“我們開展的課題就是要從日常的口岸媒介攜帶病原體檢測工作實(shí)際出發(fā)，將檢測變得更快、更準(zhǔn)確，同時(shí)又能檢測更多的病原體?！痹搱F(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人、高級工程師胡群如是說。
自建立CODEHOP RT-PCR檢測技術(shù)以后，就被應(yīng)用于大榭口岸日常檢獲的鼠類樣品攜帶漢坦病毒的檢測。2012年，大榭局研究團(tuán)隊(duì)利用該方法，在輸入性鼠類樣品中檢測出漢坦病毒陽性，屬于浙江省首例，此外，在口岸日常監(jiān)測的鼠類樣品中還檢測到了2例漢坦病毒陽性。
此外，在該項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)還研制出了檢測試劑盒。今年7月31日，該試劑盒順利通過了國家技術(shù)發(fā)明專利授權(quán)。通過該試劑盒，研究團(tuán)隊(duì)對實(shí)驗(yàn)室分離保存的漢坦型、漢城型兩個(gè)漢坦病毒樣本以及其他型別的病毒基因進(jìn)行了測試，均能得到預(yù)期效果。
這些應(yīng)用結(jié)果充分表明，大榭局公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的CODEHOP RT-PCR方法非常適用于口岸鼠類攜帶漢坦病毒的快速檢測，具有廣泛的推廣前景。
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聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。
CODEHOP PCR（一致-簡并雜合寡核苷酸引物擴(kuò)增）方法是Rose等人發(fā)明用于擴(kuò)增某種病原體或親緣關(guān)系較近的病原體的核酸檢測方法，已經(jīng)有許多研究未知病毒、細(xì)菌以及基因家族成員功能的工作因此得以開展并取得成功。
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